在实验当中平常必须监测巨噬细锥体的细锥体活着亡情形，这里总结了几种相似的细锥体活着亡监测新方国法，希望只能帮到你。
一巨噬细锥体细锥体活着亡的型态学监测
频发细锥体活着亡的巨噬细锥体在型态上有一定的外观上。
光学电子显微镜和倒置电子显微镜
未染色剂巨噬细锥体：细锥体活着亡巨噬细锥体的形量变小、变形，巨噬细锥体表皮原始但显现出来发泡现象，巨噬细锥体细锥体活着亡后期可见细锥体活着亡小形体。贴壁巨噬细锥体显现出来皱缩、变圆、破损。
染色剂巨噬细锥体：都用姬姆萨染色剂、瑞氏染色剂等。细锥体活着亡巨噬细锥体的染色剂质稀释、边缘所谓，核子表皮聚合、染色剂质一分为二出块状和细锥体活着亡小形体等迥然不同的细锥体活着亡型态。
可见光电子显微镜和共约催生等离子扫描电子显微镜
一般以巨噬体细锥体子染色剂质的型态学发生变化为这两项来面试巨噬细锥体细锥体活着亡的实质性情形。
都用的 DNA 特异性原料有：HO 33342（Hoechst 33342），HO 33258（Hoechst 33258），DAPI。三种原料与 DNA 的建构都是非笔记本电脑的，主要建构在 DNA 的 A-T 碱基区。可见光激发时导弹明亮的蓝色可见光。
Hoechst 是与 DNA 特异建构的活性原料，内而所有容器用开水混和 1 mg/ml 的pH，都用时用 PBS 酒精，终pH为 10 μg/ml。
DAPI 为半通透性，用于常规从前巨噬细锥体的染色剂。内而所有容器用开水混和 1 mg/ml 的pH，都用终pH一般为 10 μg/ml。
结果面试
巨噬细锥体细锥体活着亡过程当中巨噬体细锥体子染色剂质的型态学发生变化分为三期：Ⅰ 期的巨噬体细锥体子方形皱纹状（rippled）或方形折缝样（creased），均染色剂质显现出来稀释精神状态；Ⅱa 期巨噬体细锥体子的染色剂质水平无所不在、边缘所谓；Ⅱb 期的巨噬体细锥体子聚合为碎块，导致细锥体活着亡小形体（图 1）。
反射电子电子显微镜通过观察
结果面试
细锥体活着亡巨噬细锥体形量变小，巨噬细锥体质稀释。细锥体活着亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的巨噬体细锥体子内染色剂质水平伸总长，显现出来许多叫作气穴现象（citations）的空泡内部结构；Ⅱa 期巨噬体细锥体子的染色剂质水平无所不在、边缘所谓；巨噬细锥体细锥体活着亡的后期，巨噬体细锥体子聚合为碎块，导致细锥体活着亡小形体（图 2）。
二Annexin V 国法
甘油酰胺丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）也就是说位于巨噬细锥体表皮的内侧，但在巨噬细锥体细锥体活着亡的20世纪，PS 可从巨噬细锥体表皮的内侧翻转到巨噬细锥体表皮的表面，暴露在巨噬细锥体外环境当中（图 3）。Annexin-V 是一种水组分为 35～36 KD 的 Ca2+ 依赖性甘油建构细锥体，能与 PS 高亲和力特异性建构。将 Annexin-V 同步进行可见光素（FITC、PE）或 biotin 标示，以标示了的 Annexin-V 作为可见光探针，并用流式巨噬细锥体璇或可见光电子显微镜可监测巨噬细锥体细锥体活着亡的频发。
碘所谓丙啶（propidine iodide, PI）是一种核子酸原料，它很难更进一步原始的巨噬细锥体表皮，但在细锥体活着亡当中后期的巨噬细锥体和活着巨噬细锥体，PI 只能更进一步巨噬细锥体表皮而使巨噬体细锥体子红染。因此将 Annexin-V 与 PI 冗余都用，就可以将细锥体活着亡早后期的巨噬细锥体以及活着巨噬细锥体区别于开来。
新方国法
水或巨噬细锥体的染色剂：将也就是说培植和正向细锥体活着亡的水或巨噬细锥体（0.5～1×106）用 PBS 彩衣 2 次，转为 100 μl Binding Buffer 和 FITC 标示的 Annexin-V（20 μg/ml）10 μl，固体避光 30 min，再转为 PI（50 μg/ml）5 μl，避光自由基 5 min 后，转为 400 μl Binding Buffer，立即用 FACScan 同步进行流式巨噬细锥体术而所量监测（一般不最多 1 h）， 同时以不加在 AnnexinV-FITC 及 PI 的一管作为单数对照。
贴壁培植的巨噬细锥体染色剂：先用 0.25% 的胰复合物消所谓，彩衣涤、染色剂和研究出果同水或巨噬细锥体。
攀片巨噬细锥体染色剂：同上，最后用可见光电子显微镜和共约催生等离子扫描电子显微镜同步进行通过观察。
结果
须知
1. 整个操作方法跳跃要尽量轻柔，应双脚吹打巨噬细锥体。
2. 操作方法时注意避光，自由基天内后尽快在一小时内监测。
三线粒形体表皮动能的监测
线粒形体在巨噬细锥体细锥体活着亡的过程当中起着门户关键作用，多种巨噬细锥体细锥体活着亡刺激因子仅可正向不同的巨噬细锥体频发细锥体活着亡，而线粒形体衔接pH梯度（Δψm）的下降，被相信是巨噬细锥体细锥体活着亡级联自由基过程当中最早频发的暴力事件，它频发在巨噬体细锥体子细锥体活着亡外观上（染色剂质稀释、DNA 撕裂）显现出来之前，一旦线粒形体衔接pH梯度崩溃，则巨噬细锥体细锥体活着亡各种因素。
线粒形体衔接pH梯度的存在，使一些胺基酸阳离子可见光原料如 Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide（DiOC6）、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide（JC-1）、Tetramethyl rhodamine methyl ester（TMRM）等可建构到线粒形体基质，其可见光的增强或减弱说明线粒形体内表皮电负性的增高或降低。
新方国法
将也就是说培植的巨噬细锥体和正向细锥体活着亡的巨噬细锥体转为都用终pH为 Rhodamine 123（1 mM）或终pH为 DiOC6（25 nM），JC-1（1 mM），TMRM（100 nM），37 °C 适度 30 min，流式巨噬细锥体而所监测巨噬细锥体的可见光准确度。
须知
1. 始终保持适度染容器当中 pH 值的完整性，因为 pH 值的变所谓将影响pH梯度。
2. 与原料大幅提高适度的巨噬细锥体悬容器当中如果而所有有细锥体，他们将与均原料建构，降低原料的pH，引起假去极所谓。
四DNA 片段所谓监测
巨噬细锥体细锥体活着亡时主要的生所谓外观上是其染色剂质频发稀释，染色剂质 DNA 在核子小形体单位之间的连接处撕裂，出型 50～300 kbp 总长的 DNA 大面积段，或 180～200 bp 整数倍的寡核子苷酸片段，在PCR上表现为梯形电泳图谱（DNA ladder）。
巨噬细锥体经处理后，改用常规新方国法剥离高纯度 DNA，同步进行琼脂糖PCR和溴所谓乙啶染色剂，在细锥体活着亡巨噬细锥体群当中可通过观察到迥然不同的 DNA ladder。如果巨噬细锥体量很少，还可在剥离高纯度 DNA 后，用 32P-ATP 和脱氧核子糖核子苷酸末端丝氨酸（TdT）标示 DNA，然后同步进行电泳和放射自显影，通过观察细锥体活着亡巨噬细锥体当中 DNA ladder 的出型。
大水分子染色剂形体 DNA 片段的校准
巨噬细锥体细锥体活着亡的20世纪，染色剂形体撕裂视作 50～300 kbp 总长的 DNA 大面积段。所有最多一定水组分不等的双链 DNA 水分子在琼脂糖凝胶当中的迁移速度完全一致。等价 DNA 的脱氧核糖核酸半径最多凝胶半径时，即大幅提高分辨力的极限。此时凝胶依然按水组分的不等来筛分 DNA，DNA 像通过细管一样，以其一端抛出电场一极而通过凝胶，这种迁移的系统亦称「攀行」。因此，巨噬细锥体细锥体活着亡20世纪导致的 50～300 kbp 总长的 DNA 大面积段很难用普通的琼脂糖PCR来剥离。
通常改用延时电泳技术可圆满地解决这一问题。这个新方国法是在凝胶上外加在正交的交变延时电场。每当电场方向发生变化后，大的 DNA 水分子便滞留在攀行管当中，直至新电场垂直重新定向后，才能继续向前伸展。DNA 水组分就越，这种重排所必须的时间段就越总长。当 DNA 水分子线性变换方向的时间段相等电延时周期时，DNA 就可以按其水组分不等从前。
DNA Ladder 校准
新方国法
收出巨噬细锥体（1×107）沉淀→巨噬细锥体聚合容器→13 000 rpm ×5 min→并用上清，加在 1% SDS 和 RnaseA（5 mg/ml）56 °C，孵卵 2 h→细锥体复合物 K（2.5 mg/ml）37 °C，2 h→1/10 形量 3 mol/l 醋酸钠和 2.5 倍形量的冷无水乙醇沉淀 DNA，4 °C 过夜→14 000 rpm×15 min→最后将沉淀沉淀在 TE buffer 当中，加在 DNA Loading Buffer→1.2% 琼脂糖PCR，EB 染色剂并冲印。
结果
细锥体活着亡巨噬细锥体 DNA 甜度的流式巨噬细锥体而所研究出果
新方国法
并用巨噬细锥体→70% 冷乙醇（PBS 酒精）4 °C 从前过夜→PBS 彩衣涤，1 000 rpm × 10 min→RNase A（0.5 mg/ml）37 °C 消所谓 30 min→PI（50 mg/ml）染色剂，固体避光 15 min→FACScan 研究出果 DNA 亚原生动物的出型及巨噬基因强调的变所谓。
结果
ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay
高效率：敏感度高，适合于监测少量样本，小均细锥体活着亡巨噬细锥体。如医学活一个组织监测。
五TUNEL 国法
巨噬细锥体细锥体活着亡当中，染色剂形体 DNA 双链撕裂或脱氧核糖核酸撕裂而导致大量的粘性 3'-OH 末端，可在脱氧核子糖核子苷酸末端丝氨酸（TdT）的关键作用下，将脱氧核子糖核子苷酸和可见光素、过氧所谓物复合物、碱性磷酸复合物或NAD出型的衍生物标示到 DNA 的 3'-末端，从而可同步进行细锥体活着亡巨噬细锥体的监测，这类新方国法叫作脱氧核子糖核子苷酸末端丝氨酸细锥体内的向外末端标示国法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。
由于也就是说的或即将增殖的巨噬细锥体几乎没有 DNA 的撕裂，因而没有 3'-OH 出型，很少只能被染色剂。TUNEL 实际上是水分子生物学与型态学相建构的研究出果新方国法，对原始的单个细锥体活着亡巨噬体细锥体子或细锥体活着亡小形体同步进行原处染色剂，能准确地自由基巨噬细锥体细锥体活着亡迥然不同的生物所谓学和型态外观上，可用于石蜡包埋一个组织切片、融解一个组织切片、培植的巨噬细锥体和从一个组织当中剥离的巨噬细锥体的巨噬细锥体型态校准，并可监测出非常少的细锥体活着亡巨噬细锥体，因而在巨噬细锥体细锥体活着亡的研究出果当中被广泛改用。
六Caspase-3 活性的监测
Caspase 的王室在细锥体内巨噬细锥体细锥体活着亡的过程当中起着非常最重要的关键作用，其当中 Caspase-3 为关键因素的执行水分子，它在细锥体活着亡信号传导的许多简而言之当中发挥动态。Caspase-3 也就是说以复合物原（32 KD）的形式存在于溶菌复合物当中，在细锥体活着亡的20世纪阶段，它被抑制，活所谓的 Caspase-3 由两个大结构域（17 KD）和两个小结构域（12 KD）组出，聚合也就是说的溶菌复合物锥体核子残基，再一导致巨噬细锥体细锥体活着亡。但在巨噬细锥体细锥体活着亡的后期和活着亡巨噬细锥体，Caspase-3 的活性明显下降。
Western blot
研究出果 Procaspase-3 的活所谓，以及活所谓的 Caspase-3 及对残基多聚（ADP-核子糖）聚合复合物（PARP）等的聚合。
新方国法
并用巨噬细锥体→PBS 彩衣涤→抽提巨噬细锥体聚合容器→细锥体而所量→SDS-PAGE 电泳→纤维素表皮或 PVDF 表皮转移→5% 脱脂清空，固体 1.5～2 h 或 4 °C 过夜→Caspase-3 多抗或类药物固体自由基 1～2 h 或 4 °C 过夜→TBS-T（而所有 0.05% Tween 20 的 TBS）彩衣 3 次，5～10 min/次→HRP-标示的羊抗鼠 IgG 或 AP 标示的羊抗鼠 IgG 固体自由基 1～2 h→ TBS-T 彩衣 3 次， 5～10 min/次→ECL 显影或 NBT/BCIP 过氧化。
结果
可见光分光光度而所研究出果
活所谓的 Caspase-3 只能特异切割 D1E2V3D4-X 残基，降解 D4-X 酶键。根据这一特点，设而所出可见光物质衍生物的短酶 Ac-DEVD-AMC。在共约价衍生物时，AMC 很难被激发可见光，短酶被降解后释放出 AMC，自由的 AMC 才能被激发导弹可见光。根据释放的 AMC 可见光准确度的不等，可以校准 Caspase-3 的活性，从而反映 Caspase-3 被活所谓的程度。
新方国法
收出巨噬细锥体也就是说或细锥体活着亡巨噬细锥体→PBS 彩衣涤→化学合成巨噬细锥体聚合容器→加在 Ac-DEVD-AMC（caspase-3 可见光残基）→37 °C 自由基 1 h→可见光分光光度而所（Polarstar）研究出果可见光准确度（激发相干 380 nm，导弹相干为 430～460 nm）。
结果
流式巨噬细锥体术研究出果
新方国法
收出巨噬细锥体也就是说或细锥体活着亡巨噬细锥体→PBS 彩衣涤→加在 Ac-DEVD-AMC→37 °C 自由基 1 h→UV 流式巨噬细锥体而所研究出果 Caspase-3 阳性巨噬细锥体数和少于可见光准确度。
结果
七TFAR19 细锥体强调和巨噬细锥体取向研究出果
TFAR19（PDCD5）是由本研究出果室在当今首先华盛顿邮报的一个享有自己自主的人类新基因，前期的动态研究出果表明，它是促进巨噬细锥体细锥体活着亡的增强剂。并用可见光素（FITC）标示的 TFAR19 单克隆抗原为探针，对巨噬细锥体细锥体活着亡过程当中 TFAR19 细锥体的强调素质及取向研究出果挖掘出，细锥体活着亡20世纪 TFAR19 强调素质增高并显现出来快速核子七度现象，有如着巨噬体细锥体子型态学的变所谓，持续较总长时间段，在细锥体活着亡小形体当中仍然可见。
同时我们挖掘出，细锥体活着亡20世纪 TFAR19 细锥体的核子七度早于甘油酰胺丝氨酸（PS）外翻和巨噬体细锥体子 DNA 的片段所谓，提示 TFAR19 细锥体的核子七度是巨噬细锥体细锥体活着亡更20世纪频发的暴力事件之一。有利于的研究出果假定，细锥体活着亡20世纪 TFAR19 的核子七度具有普遍意义，不同巨噬细锥体细锥体活着亡20世纪仅显现出来 TFAR19 高强调和核子七度。这为研究出果巨噬细锥体细锥体活着亡20世纪所频发的暴力事件，共享了一种新技术和这两项。
TFAR19 细锥体的巨噬细锥体取向研究出果
涂料试剂
FITC 标示的单克隆抗原，pH 7.4 、0.15 mol/L PBS，3% 的多聚甲醛，PBS-T（pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 而所有 0.2% Tween 20），胎牛肝细锥体，可见光巨噬细锥体彩衣容器（pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 而所有 2% 胎牛肝细锥体及 0.1% NaN3），FACS 管，Tip 头，移容器器。
璇器
高温素质离心机，37 °C 水浴箱，可见光电子显微镜，共约催生等离子扫描电子显微镜，流式巨噬细锥体璇。
新方国法
1. 水或巨噬细锥体的染色剂
（1）收出也就是说和正向细锥体活着亡的巨噬细锥体（0.5～1×106），PBS 彩衣 2 次，1 000 rpm×10 min。
（2）3% 多聚甲醛冰浴 10 min，PBS 彩衣 2 次，1 000 rpm×10 min。
（3）转为 PBS-T 溶容器，37 °C 孵卵 15 min，PBS 彩衣 2 次，1 000 rpm×10 min。
（4）转为 200 ml 胎牛肝细锥体，固体自由基 30 min。
（5）转为 5 ml FITC 标示的 TFAR19 类药物（终pH为 1:40），4 °C 自由基 30 min。
（6）可见光巨噬细锥体彩衣容器彩衣 2 次，1 000 rpm×10 min。
将巨噬细锥体沉淀滴片，可见光电子显微镜及共约催生等离子电子显微镜下通过观察 TFAR19 在巨噬细锥体当中的取向。同时用流式巨噬细锥体璇而所量监测 TFAR19 细锥体的少于可见光准确度。
2. 贴壁巨噬细锥体的原处染色剂
（1）贴壁潮湿的对数期巨噬细锥体铺在 24 孔或 6 孔支架当中（内有洁净盖玻片），让其攀片潮湿，待总长到 50%～80 % 满时，细锥体活着亡正向剂处理巨噬细锥体。
（2）将不同时间段点处理的巨噬细锥体同步进行免疫可见光染色剂，染色剂步骤同上。
（3）将染色剂的攀片巨噬细锥体放于一张滴有少量（5 ml）的载玻片上，可见光电子显微镜或共约催生等离子扫描电子显微镜通过观察 TFAR19 在巨噬细锥体当中的取向。
3. 医学病理切片的染色剂、监测
4. 原代巨噬细锥体的培植、监测
5. 研究出果 TFAR19 细锥体在人形体内各一个组织器官的分布及取向
TFAR19 细锥体的强调与医学结核病
ELISA 国法监测也就是说人和结核病精神状态下，以及结核病的不同时期，肝细锥体当中 TFAR19 细锥体素质及其 TFAR19 自身抗原素质。
涂料和试剂
1. 特罗斯季亚涅齐 Buffer：pH 9.6， 0.05 mol/L 碳酸盐 Buffer
2. 彩衣涤容器： pH 7.4，0.15 mol/L PBS 而所有 0.05% Tween 20
3. 清空容器： 3% BSA（用彩衣涤容器配制）
4. 复合物标抗原的酒精：用清空容器酒精
5. OPD 残基 Buffer：Na2 HPO4·12 H2O 1.84 g，柠檬酸 0.51 g，DDW 100 ml
6. 过氧化容器（现配现用）：残基 Buffer 10 ml，OPD 2 mg，30% H2O2 2 ml
7. 终止容器 2 mol/L H2SO4
8. 重新组建人 TFAR19，HRP 标示的羊抗人 IgG9 ELISA 支架，Tip，移容器器，ELISA Reader（OD 490 nm），彩衣支架机
操作方法步骤
1. 用特罗斯季亚涅齐 Buffer 酒精的重新组建人 TFAR19（1 mg/ml）特罗斯季亚涅齐 ELISA 支架，100 ml/well，37 °C 孵卵 2 h 或 4 °C 过夜（一般 24 h 以上）。
2. 彩衣涤 Buffer 彩衣支架三次，转为清空容器，200 ml/well ， 37 °C 孵卵 2 h 或 4 °C 过夜。
3. 彩衣涤 Buffer 彩衣支架三次，转为不同酒精度的病人肝细锥体（3 个重复孔）100 ml/well ，37 °C 孵卵 1 h。设特罗斯季亚涅齐 Buffer、彩衣涤 Buffer 、清空容器为单数对照。
4. 彩衣涤 Buffer 彩衣支架三次，转为 1:2 500 酒精的 HRP 标示的抗人 IgG， 100 ml/well，37 °C 孵卵 1 h。
5. 彩衣涤 Buffer 彩衣支架三次，转为过氧化容器，100 ml/well，避光自由基 10～15 min。
6. 转为 H2SO4 终止自由基，50 ml/well。
7. ELISA Reader 读取 OD 490 光密度值，研究出果和比较病人肝细锥体和也就是说血 清当中 TFAR19 自身抗原的强调素质。
8. Western blot 研究出果原发性巨噬细锥体和也就是说巨噬细锥体的 TFAR 19 细锥体的强调素质。
参考文献
Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039
Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507
文章来源：丁香园站友 midas
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编辑： 任悠悠相关新闻
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